Im Jahr 2012 wird ein scheinbar gewöhnlicher Barkeeper namens Desmond Miles von einer mysteriösen Organisation entführt. Die Entführer schliessen Desmond an ein seltsames Gerät namens "Animus" an, mit dem er auf die Erinnerung seines Vorfahren, eines Mörders namens Altaïr, zugreifen kann. Aus irgendeinem Grund ist die Rekonstruktion von Altaïrs Erinnerungen für die Entführer von entscheidender Bedeutung.
Nachdem Desmond auf Altaïrs Gedächtnis zugegriffen hat, kann er die Ereignisse im Heiligen Land im Jahr 1191, der Zeit des dritten Kreuzzugs, nachvollziehen. Al Mualim, der Anführer der Attentäter, befiehlt Altaïr, neun bedeutende historische Persönlichkeiten zu töten, die angeblich Krieg und Korruption das Heilige Land erobern liessen.
Während des grössten Teils des Spiels kontrolliert der Spieler Altaïr; Es wird jedoch deutlich darauf hingewiesen, dass die Kontrolle über ihn ein Teil von Desmonds Erfahrung ist. Der Spieler kann Desmond auch zwischen seinen Sessions im "Animus" steuern.
Das innovativste Merkmal des Spiels ist die Freiheit der Wahl und der Bewegung. Jedes architektonische Detail wie Fensterleisten, Schnitzereien im Stein oder Holzstangen können verwendet werden, um sich an den Wänden zu bewegen. Dies ermöglicht dem Spieler intensive Verfolgungsjagden, wenn Sie zufällig von der Wache gejagt werden.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie Sie Ihr Ziel im Spiel erreichen können. Mithilfe von Abhören, Verhör und Taschendiebstahl können Sie Informationen über Ihr nächstes Ziel herausfinden. Anhand dieser Informationen können Sie dann auswählen, ob Sie die Ziele durch einen vollständigen Frontalangriff oder mit einem ordnungsgemäss platzierten Wurfmesser aus der Abdeckung der Dächer angreifen möchten.
Abhängig von Ihrer Wahl müssen Sie sich mit den Bürgern und Rittern der Städte auseinandersetzen, die Verdacht schöpfen, wenn sich eine getarnte Person auf den Dächern oder in der Nähe der Missionsziele wundert. Es gibt mehrere Situationen, in denen Sie sich in die Masse einmischen können. Mit etwas Glück können Sie Ihr Ziel ausschalten, ohne dass jemand in Ihre Richtung schaut. Altaïr hat ein kleines, aber effektives Arsenal an Waffen, wie Schwertern und Wurfmessern, und er kann neue Kampffertigkeiten erlernen, um ihm bei seiner Mission zu helfen.