Assassin's Creed III ist ein historisches Action-Adventure-Spiel mit offener Welt und Schwerpunkt auf Stealth. Trotz der Nummerierung ist es das fünfte Hauptspiel der Serie und eine direkte Fortsetzung des vorherigen Spiels Assassin's Creed: Revelations. Nach den Ereignissen des vorherigen Spiels reist der Protagonist der Serie, Desmond Miles, mit Vater William und den beiden Gefährten Rebecca und Shaun in eine Höhle in New York, wo sie einen von Mitgliedern der Ersten Zivilisation errichteten Tempel gefunden haben. Mit dem Apple of Eden kann Desmond einen grossen Teil der Ausrüstung aktivieren. Es wurde gebaut, um die Erde vor einer Sonneneruption zu schützen, die den Planeten auszulöschen droht. Desmond gerät jedoch in einen Fugenzustand und wird in Animus, die Virtual-Reality-Maschine, die es ihm ermöglicht, seine Ahnenerinnerungen zu erleben, gebracht. Er wird Animus verwenden, um Antworten auf die Warnung der Ersten Zivilisation und die Bedrohung durch die Tempelritter und ihre moderne Organisation Abstergo Industries zu finden.
Ausgehend von dieser anfänglichen modernen Umgebung spielt der Rest des Spiels vor, während und nach der amerikanischen Revolution von 1753 bis 1783 im kolonialen Amerika. Der Hauptprotagonist für dieses Spiel ist Ratonhnhaké:ton (Connor), ein Mitglied der Mohawk Stamm. Er wird erst nach einem wesentlichen Teil des Spiels vorgestellt, da es zunächst seinem Vater, dem Londoner Haytham Kenway, folgt, der nach dem Töten eines Assassinen in der Londoner Oper nach Amerika reist. Der Spieler erlebt das Gameplay des Opernmordes, die Reise auf dem Boot und die Ankunft in Boston. Haytham ist ein Templer. Er hat einen Schlüssel in der Oper gestohlen und arbeitet mit fünf Männern zusammen, die seiner Sache treu ergeben sind, um ein Lagerhaus zu finden, für das der Medaillonschlüssel bestimmt ist. Als er sich auch auf die lokalen Ereignisse einlässt, lernt er die Mohawk-Frau Kaniehti:io (Ziio) kennen und sie bringt Connor zur Welt. Das Spiel bietet dann 30 Jahre Lebenszeit für Connor, angefangen von seiner Kindheit beim Mohawk-Stamm bis hin zur Ausbildung zum Assassinen, nachdem sein Dorf von den Templern unter dem Kommando seines Vaters angegriffen wurde. Der Assassin-Templer-Krieg wird dann Teil der amerikanischen Revolution.