Desmond Miles, der letzte in der Reihe der alten Assassinenorden, wurde von den heutigen Nachkommen der Templer gefangen genommen, die gezwungen waren, vergangene Ereignisse mit einem Gerät namens Animus zu erleben, um wichtige Informationen zu erhalten. Einer der Wissenschaftler wechselt jedoch unerwartet die Seite und bittet Desmond, ihr sein Vertrauen zu schenken und ihr aus dem Komplex zu folgen. Bald darauf entkommen sie der Festung und verbünden sich mit einigen neuen Verbündeten, die Desmonds Wissen gegen die Templer einsetzen wollen. Ihr neues Gerät heisst Animus 2.0, eine aktualisierte Version des Originals. Diesmal erlebt Desmond das Leben von Ezio Auditore di Firenze, einem Mann, der im 15. Jahrhundert in Italien lebte.
Ezio ist ein ausgelassener, scheinbar unbekümmerter junger Mann, der gerne Kämpfe austrägt und Röcke jagt. All das ändert sich, wenn sein Vater und sein kleiner Bruder öffentlich von einem Mann hingerichtet werden, dem er vertraut. Angetrieben von Rache beginnt Ezio, mehr über das Leben seines Vaters zu erfahren und stellt fest, dass auch er zur Organisation der Assassinen gehörte. Ezio wird selbst ein geschickter Attentäter und ist bereit, den Tod der Menschen, die er liebte, zu rächen.
Assassin's Creed II ist ein frei laufendes Actionspiel, das in Konzept und Spielmechanik seinem Vorgänger sehr ähnlich ist. Die Ereignisse des Spiels finden in Florenz, Venedig, Rom und anderen Orten in Italien statt. Neben fiktiven Charakteren hat das Spiel berühmte historische Figuren aus der Zeit, wie Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Cesare Borgia und andere, die eine aktive Rolle in der Geschichte des Spiels spielen. Authentisches kulturelles und politisches Umfeld der italienischen Renaissance ist im Spiel zusammen mit fiktiven Berichten über Ereignisse, alternative Geschichte und metaphysische Theorien vertreten.
Das Kernspiel ähnelt dem des vorherigen Spiels. Der Protagonist kann mehrere grosse Städte und ländliche Orte zu Fuss oder zu Pferd erkunden. Es ist auch möglich, im Spiel zu schwimmen und Boote zu navigieren. Fast jedes Gebäude kann bestiegen werden, und der Protagonist kann die höchsten Dächer betreten und mit seiner Eagle Vision das Panorama beobachten. Das Springen und Laufen in freier Form nimmt einen erheblichen Teil des Gameplays ein.
Eine der bemerkenswertesten Ergänzungen der Fortsetzung ist das Finanzsystem, das im ersten Spiel nicht vorhanden war. Gegenstände, Waffen und Rüstungen können in Geschäften gekauft und für Geld repariert werden. Es gibt viel mehr Waffentypen und einzelne Waffen und Rüstungen im Spiel. Ezio kann Schwerter, Dolche, Wurfmesser, Rauchbomben, eine Pistole und verschiedene aufrüstbare Rüstungstypen tragen. Waffen können auch von gefallenen Feinden aufgenommen und im selben Kampf eingesetzt werden. An verschiedenen Stellen der Spielwelt kann reichlich Schatz gesammelt werden.
Es gibt neue Wege, in dieser Fortsetzung heimlich zu sein. Ezio kann Kurtisanen bezahlen, um Wachen abzulenken, Söldner einstellen, um sie zu bekämpfen, oder Diebe beauftragen, eine Ablenkung zu schaffen. Die Missionsziele und insbesondere die dafür erforderlichen Schritte sind merklich vielfältiger als im vorherigen Spiel. Der Protagonist erhält oft neue Ausrüstung und neue Herausforderungen zum Experimentieren. Einige davon sind wie Minispiele aufgebaut: Zum Beispiel wird Ezio irgendwann ein Fluggerät steuern. Die Hauptfigur hat ein eigenes Hauptquartier im Spiel, ein Herrenhaus und eine angrenzende Kleinstadt. Es ist möglich, Geld in den Wiederaufbau der Stadt zu investieren und das Herrenhaus anzupassen.
Das Spiel bietet eine bedeutend grössere Anzahl von Nebenaufgaben als sein Vorgänger. Eine Reihe von Unteraufträgen beinhaltet das Auffinden, Sammeln und Entschlüsseln alter Weisheitswörter, die angeblich das Geheimnis des Universums bergen. Diese Quests beinhalten häufig das Durchqueren komplexer Plattformumgebungen in Innenräumen, um das Ziel zu erreichen. Diese Sequenzen erfordern präzises Springen und enthalten leichte Elemente zum Lösen von Puzzles, ähnlich wie die heutigen Prince of Persia-Spiele.